做胰腺相關科研的小伙伴，大概率都被「小鼠胰腺星狀細胞（PSC）原代分離」難住過：明明跟著流程走，卻反復出現細胞活性低、爬出率不足、污染頻發，甚至全瓶細胞壞死的情況；耗費了大量小鼠樣本、試劑和時間，卻連基礎的細胞鋪板都做不好，直接拖慢整個實驗進度。

其實，小鼠胰腺星狀細胞原代分離的核心不在于“步驟齊全"，而在于“細節把控"——從試劑選型、儀器調試到每一步操作的力度、時長，哪怕一個小疏忽，都可能導致實驗功虧一簣。今天，我們結合長期實驗經驗，整理了一份專屬科研人的實用的分離培養指南，無冗余、無雷同，精準破解分離難題，幫你一次搞定PSC原代分離！

一、實驗前置準備：細節拉滿，從源頭降低失敗率

小鼠胰腺星狀細胞原代分離的成功率，80%取決于前置準備的細致度。不同于常規細胞培養，胰腺組織質地脆弱、易污染，因此所有試劑、儀器、器材都需嚴格遵循“無菌、精準、適配"原則，提前做好核對與處理。

（一）所需試劑（精準適配小鼠胰腺星狀細胞，拒絕通用替代）

iCell原代星狀細胞培養體系：專為小鼠胰腺星狀細胞定制，含細胞生長所需的專屬營養因子，能顯著提升細胞貼壁率與活性，減少原代細胞分離過程中的損傷，相比普通培養基，可將實驗失敗率降低60%以上；

緩沖液：無菌1×PBS（pH=7.2），用于胰腺組織清洗、細胞緩沖，pH值需嚴格校準（偏差不超過±0.1），避免酸堿環境影響細胞活性，導致細胞難以爬出；

清洗液：無菌1×PBS（含5×雙抗P/S），雙重抑菌配方，可有效抑制細菌、真菌滋生，保護胰腺組織完整性，避免清洗過程中引入污染；

消化液：0.1%胰蛋白酶，溫和消化胰腺組織，既能打破組織間連接，又不會過度消化導致細胞破裂，大程度保留細胞活性；

75%無菌酒精：用于小鼠體表ce底除菌，殺滅毛發、皮膚表面的微生物，從源頭減少解剖過程中的污染隱患；

雙抗（P/S）：青霉素-鏈霉素混合液，輔助強化無菌環境，可按需加入清洗液、培養基中，進一步降低污染風險；

0.1mg/ml多聚賴氨酸：用于包被T-25培養瓶，增強胰腺星狀細胞的貼壁能力，減少細胞脫落，為細胞快速鋪展生長提供支撐。

（二）所需儀器（提前調試，確保運行穩定）

超凈工作臺：實驗核心無菌環境，使用前需紫外滅菌30min，通風15min后再進行操作，操作過程中避免打開工作臺玻璃門，防止雜菌進入；

臺式離心機：用于后續細胞離心處理（本流程核心步驟暫未涉及，可提前調試至適宜轉速，做好備用，避免臨時調試影響實驗節奏）；

電動移液器：精準控制試劑、組織塊吸取量，避免手動操作的誤差，使用前需進行高壓滅菌處理，確保無菌無雜質；

熒光倒置顯微鏡：用于全程觀察細胞生長狀態，重點監測組織塊貼壁情況、細胞爬出進度，便于及時調整培養策略，避免錯過好的處理時機。

（三）所需器材（無菌處理，杜絕污染漏洞）

移液管：分規格備用（適配不同試劑轉移需求），滅菌后密封保存，使用時避免觸碰非無菌區域，防止交叉污染；

15ml/50ml離心管：用于組織、細胞的離心處理，提前進行高壓滅菌，確保管內無殘留雜質、無破損，避免離心過程中漏液污染；

眼科剪、眼科鑷：用于小鼠腹腔解剖、胰腺組織分離及修剪，需選用精細無菌款，避免刃口粗糙損傷胰腺組織，影響細胞活性；

80目不銹鋼網篩：用于過濾胰腺組織碎片，獲得純凈的組織塊（可根據實驗需求靈活選用，過濾后及時清洗滅菌，便于重復使用）；

10cm培養皿：用于胰腺組織的清洗、修剪、剪碎，提前加入少量清洗液，保持組織濕潤，避免組織失水壞死。

二、分步實操流程：精準拆解，每一步都有避坑技巧

本流程專為4-8周齡健康小鼠設計，操作核心圍繞“無菌、輕柔、精準"，全程規避科研人常踩的雷區，新手也能輕松上手，確保分離出的小鼠胰腺星狀細胞純度高、活性好。

1. 小鼠處死與體表除菌：選取4-8周齡健康小鼠（體重均勻，無疾病、無感染，優先選用SPF級小鼠），采用頸椎脫臼法快速處死，避免小鼠長時間掙扎導致組織損傷；立即將小鼠放入75%無菌酒精中浸泡3-5min，期間輕輕晃動小鼠，確保體表所有部位都能接觸酒精，ce底殺滅體表微生物。

【避坑提醒：酒精浸泡時間不可過長（超過5min），否則會損傷小鼠體表組織，間接破壞胰腺活性，導致后續細胞爬出率下降】

2. 胰腺組織分離：酒精浸泡完成后，迅速將小鼠轉入無菌超凈工作臺內，用無菌眼科剪沿腹中線輕輕剪開腹腔，用眼科鑷緩慢撥開腸道，找到暗紅色、不規則形的脾臟；輕輕翻開脾臟，其下方即可看到淡黃色、質地柔軟、呈分葉狀的胰腺組織；用眼科鑷輕輕固定胰腺，配合眼科剪緩慢剪下，立即放入預先裝有含1×P/S的PBS清洗液的10cm培養皿中浸泡，防止組織干燥、失水壞死。

【避坑提醒：解剖動作務必輕柔，避免戳破腸道、肝臟等器官，防止腸道內容物、血液等雜質污染胰腺組織，影響分離純度】

3. 胰腺組織修剪：收集多只小鼠的胰腺組織（根據實驗需求，確保獲得足夠體積的純凈組織），在超凈工作臺內，用無菌眼科鑷固定胰腺，配合無菌眼科剪，仔細修剪去除胰腺表面的被膜、較大的胰腺導管及附著的血管、脂肪組織，盡量保留純凈的胰腺實質組織。

【避坑提醒：修剪時力度要輕，避免過度擠壓、剪切胰腺實質，否則會導致細胞損傷，降低細胞活性；雜質務必修剪干凈，殘留雜質會增加污染風險，還會影響后續細胞分離純度】

4. 組織塊剪碎處理：將修剪干凈的胰腺組織轉入另一個無菌10cm培養皿中，加入少量無菌1×PBS緩沖液保持組織濕潤，用無菌眼科剪將胰腺剪成1mm×1mm×1mm大小的均勻組織塊，剪碎過程中可多次用PBS沖洗，去除組織碎屑。

【避坑提醒：組織塊大小需均勻一致，不可過大（細胞難以爬出）或過小（易破裂失活）；剪碎時避免產生過多組織碎屑，碎屑會影響后續組織塊貼壁】

5. 組織塊貼壁培養：提前用0.1mg/ml的多聚賴氨酸對T-25培養瓶進行包被處理，包被后置于超凈工作臺內晾干備用（包被不ce底會導致細胞貼壁不牢、易脫落）；用20μl無菌電動移液器吸取剪好的胰腺組織塊，均勻鋪展在包被好的T-25培養瓶培養面，暫不添加培養基，將培養瓶置于37℃、5%二氧化碳培養箱中靜置貼壁2h，讓組織塊充分吸附在培養瓶表面。

【避坑提醒：組織塊鋪展需均勻，避免堆積；靜置期間不可移動培養瓶，防止組織塊脫落，影響貼壁效果】

6. 培養基添加與繼續培養：靜置2h后，取出培養瓶，在超凈工作臺內，先向培養瓶的非培養平面側緩慢加入2ml iCell原代星狀細胞wan全培養基，避免直接沖擊貼壁的組織塊（防止組織塊脫落、細胞損傷）；隨后緩慢轉動培養瓶，使培養基均勻漫過培養平面上的組織塊，確保每塊組織都能充分接觸培養基，再將培養瓶放回37℃、5%二氧化碳培養箱中繼續培養。

【避坑提醒：培養基添加需緩慢，轉動培養瓶時動作輕柔，避免產生氣泡，氣泡會影響細胞貼壁和生長】

7. 細胞生長觀察：培養1-2天后，通過熒光倒置顯微鏡觀察，可見組織塊周圍有少量胰腺星狀細胞爬出（呈梭形、形態規則，無異常形態）；培養4-5天后，組織塊周圍會有大量細胞鋪展生長，細胞形態均勻、活性良好，此時可根據實驗需求，進行后續的細胞換液、傳代或相關檢測操作。

【避坑提醒：培養期間需每天觀察細胞狀態，若發現培養基渾濁、有雜菌（如白色沉淀、渾濁發黃），需及時更換培養基，避免污染擴散，導致整個實驗失敗】

三、核心避坑總結：這些錯誤千萬別犯！

很多科研人實驗失敗，并非流程不對，而是忽略了這些關鍵細節，整理了以下高頻踩雷點，幫你避開所有彎路：

無菌操作不到位：這是常見的失敗原因！所有試劑、儀器、器材必須嚴格滅菌，超凈工作臺需提前消毒，實驗人員需穿戴無菌手套、口罩、實驗服，避免人為污染；

組織處理過于粗暴：胰腺組織質地脆弱，解剖、修剪、剪碎過程中動作過重，會導致細胞損傷，直接影響細胞活性和爬出率；

試劑配比/參數偏差：PBS緩沖液pH值、多聚賴氨酸濃度、胰蛋白酶濃度需嚴格按照要求配制，偏差會直接導致細胞活性下降、貼壁失敗；

觀察不及時：培養期間未及時觀察細胞狀態，錯過污染、組織塊脫落等問題好的處理時機，導致實驗功虧一簣；

樣本選擇不當：選用年老、體弱或患病的小鼠，其胰腺組織活性差，分離難度大，大概率會導致實驗失敗，優先選用4-8周齡健康小鼠。

四、科研助力：專屬咨詢，幫你搞定所有難題

小鼠胰腺星狀細胞原代分離，看似簡單，實則每一個細節都關乎實驗成敗。如果你在實操中遇到「細胞爬出少、污染反復、活性不足」等問題，或是需要定制化實驗方案、試劑選型建議，無需自行摸索，直接私信我們咨詢！

后續我們還會持續更新各類細胞原代分離、培養實操干貨，涵蓋不同細胞類型、實驗場景，更有專業技術人員一對一答疑，拒絕雷同、拒絕冗余，記得持續關注，解鎖更多科研小技巧，幫你快速解決實驗難題，節省時間和樣本成本，助力科研高效推進！讓你的實驗少走彎路、事半功倍～